Damit Gewebeproben unter dem Mikroskop untersucht werden können, müssen sie in mehreren Schritten vorbereitet werden: Nach der Fixierung zur Erhaltung der Strukturen folgen Einbettung, Schneiden und schließlich die Färbung, die die ansonsten farblosen Zellen sichtbar macht.
1. Fixierung:
Die Fixierung sorgt dafür, dass Gewebe in seiner Struktur stabil bleibt. Dafür werden chemische Substanzen eingesetzt, die biologische Prozesse stoppen und Proteine denaturieren.
- Ziele der Fixierung
- Schutz vor Autolyse und Strukturveränderungen
- Reduktion enzymatischer Aktivität
- Langfristige Stabilisierung der Gewebemorphologie
- Typische Fixierungsmittel
- Aldehyde (z. B. Formaldehyd) → Quervernetzung von Proteinen
- Alkohole (z. B. Ethanol) → Entzug von Wasser, Denaturierung
Säuren/Schwermetalle (z. B. Essigsäure, Sublimat) → seltener
2. Paraffineinbettung:
- Da fixiertes Gewebe allein nicht hart genug für feine Schnitte ist, wird es in ein schneidbares Medium eingebettet – meist Paraffin.
- Ablauf der Paraffineinbettung:
- Zuschnitt: Makroskopische Begutachtung und Zuschnitt auf geeignete Größe
- Entwässerung: Aufsteigende Alkoholreihe zur Entfernung des Wassers
- Intermedium: Einsatz von Xylol als Übergangslösung zwischen Alkohol und Paraffin
- Infiltration: Durchtränkung des Gewebes mit erwärmtem Paraffin
- Einblocken: Gießen in Formen, Paraffin erstarrt und bildet schneidbare Blöcke
- Alternativen zum Paraffin
- Kunststoffe, Gelatine, Agar, Nitrocellulose
- Für Lichtmikroskopie: Dünn- und Semidünnschnitte
- Für Elektronenmikroskopie: Ultradünnschnitte
3. Schneiden:
Die eingebetteten Gewebeproben werden mit einem Mikrotom in dünne Schnitte von 0,1 bis 100 μm (in der Praxis meist etwa 2 μm) zerteilt.
- Ablauf
- Paraffinschnitte werden von Mikrotom auf Wasseroberfläche (45 °C) übertragen
→ Durch die Oberflächenspannung des Wassers glätten sich die Schnitte
- Paraffinschnitte werden von Mikrotom auf Wasseroberfläche (45 °C) übertragen
- Aufziehen auf einen fettfreien Glasobjektträger
- Trocknung der Objektträger auf Wärmeplatte
- Erwärmung für 30 Minuten in Wärmeschrank (60°C), damit überschüssiges Paraffin schmilzt und ablaufen kann
- Serienschnitte: Mehrere aufeinanderfolgende Schnitte erlauben 3D-Rekonstruktionen oder das Studium verschiedener Ebenen
4. Färbung:
Die Färbung macht Zellstrukturen sichtbar, die sonst farblos erscheinen.
- Ablauf der Färbung
- Entparaffinierung: Entfernung des Paraffins über Xylol und absteigende Alkoholreihe → Rückkehr ins wässrige Milieu
- Färbung: Eintauchen in spezifische Farblösungen (z. B. HE, PAS, Immunhistochemie)
- Spülung: überschüssige Farbe wird ausgewaschen
- Entwässerung: erneute aufsteigende Alkoholreihe
- Eindecken: Probe wird mit einem Deckglas abgeschlossen, Ränder ggf. versiegelt → Dauerpräparat
Färbestraße für die HE-Färbung:
